ISによるプラスミドの変異を抑制するコンピテントセル
DynaCompetent® Cells IS-mutation Safe (旧商品名：LowInSeq)
製品の特長
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DNA型転移因子（Insertion Sequence Element, IS）によるプラスミドの変異を抑制
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遺伝子クローニングやプラスミド調製に
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特に大腸菌に負荷のかかる大きなプラスミド等のクローニングに有用
※本製品は株式会社バイオパレットの特許技術である“切らないゲノム編集®” Target-AID®によって開発されました。
製品内容
ゲノム中のDNA型転移因子（Insertion Sequence Element, IS）の活性を低下させた大腸菌コンピテントセルです。ISのプラスミドへの挿入を抑制し，プラスミド調製を確実に行うことができます。大腸菌にとって負荷がかかる，大きいプラスミド等のクローニングに有用です。
高コピーのプラスミド，タンパク質を過剰発現し続けるプラスミド，サイズの大きなプラスミド等は，形質転換された大腸菌に負荷を与えています。また，非誘導時の発現用プラスミドからもわずかに目的タンパク質が基底発現しており，大腸菌に負荷を与える場合があります。
一方，大腸菌の細胞質内では大腸菌ゲノム由来のIS(動き回る遺伝子)の転移が，大腸菌ゲノムやプラスミドに対して起きています。
ISがプラスミドに挿入され，遺伝子の破壊やコピー数の変化が生じた場合，プラスミド由来の負荷が軽減され，大腸菌の増殖速度または生存率が上昇することがあります。それらのISによる変異を有するプラスミドを持つ大腸菌クローンは，大腸菌の集団内での割合を増加させ，精製したプラスミドでは変異を有するプラスミドの割合が上昇してしまいます(下記実験データをご覧ください)。
IS-mutation Safeはこの問題を軽減するために開発されたコンピテントセルです。
参考文献
Nishida, K., et al., Science, 353, aaf8729 (2016).［PMID: 27492474］
Banno, S., et al., Nature Microbiol., 3, 423-429b(2018).［PMID: 29403014］
Fan, C., et al., ACS Synth. Biol., 20;8(9):2141-2151(2019)［PMID: 31375026］
仕様
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形質転換効率：＞1 × 108 CFU/μg（pUC19）
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10×1 ml SOC medium添付
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カルタヘナ法規制に該当しません
プラスミドの大腸菌への導入・増幅時に実はこんな問題が起きています
DynaCompetent® Cells IS-mutation Safe
本製品はDH5αを元株として，大腸菌ゲノム中のISのうち，IS2，IS5，IS10，ISEc63(類似配列) (計25コピー)のトランスポザーゼ翻訳領域中にTarget-AID®を用いて終止コドンを導入し，ISの活性を低下させた＊1 大腸菌コンピテントセルです。
＊1 ISの活性は低下しているものの，ISが転移しないことを保証するものではありません。
プラスミドへのIS挿入が減少
プラスミドに対するIS挿入頻度の低下の確認
本製品および大腸菌DH5α株をアンピシリン耐性プラスミド（30 kb, pUC Ori）で形質転換後，24時間液体培養し，さらに6回まで継代培養を行った。上記それぞれの培養時にプラスミドを精製し，HiSeqでの次世代シークエンシングを行い，プラスミドのうちIS＊2の挿入されたものの概算比率を推定した＊3, 4。
DH5α株に対して本製品ではプラスミドへのISの挿入が抑制された。
＊2 IS：IS1, IS2, IS3, IS4, IS5, IS10, IS30, ISEc5, IS609, ISEc63の合計数。
＊3 DH5α株は+6回継代培養時点で計算上100%を越えており，1つのプラスミドに2つ以上のISが挿入されたことが示唆される。
＊4別途，DH5α株に同プラスミドを挿入し，6回の継代培養後9クローンを単離し，サンガーシークエンシングを行ったところ，すべてのクローンにISEc63類似配列が挿入されており，プラスミドへのIS挿入率の高さが裏付けられた。
上記のプラスミドをBamHⅠで消化し，アガロースゲル電気泳動を行った。 本プラスミドのBamHⅠサイトは2つであり，本来2本のバンドが生じるが，継代回数を重ねることによりDH5α株ではバンドパターンに変化が確認された。プラスミドへのISの挿入が示唆される。 一方，本製品で継代したプラスミドでは，バンドパターンの変化が抑制されていた。
プラスミド上の機能領域へのISによる損傷を防いだ例
lac promoter制御下にGFPを有するプラスミド（上記「プラスミドへのIS挿入が減少」のグラフや泳動図とは異なるプラスミド）によって，本製品および大腸菌DH5α株を形質転換した。得られたコロニーを用いて18時間の液体培養を行い，さらに6回まで継代培養を行った。継代培養後，培養液をLBプレートに塗布し，一晩培養を行った。得られたコロニーについて，GFPの蛍光を観察した。
その結果，DH5αでは出現したコロニーのうち48.6％でGFPの蛍光が消失または減弱したが，本製品ではGFPの蛍光が消失または減弱したコロニーは確認されなかった。DH5α株においてGFPの蛍光が消失または減弱したコロニーからプラスミドを抽出し，シークエンシングを行ったところ，いずれのクローンでもlac promoter中，またはlac promoterとGFP遺伝子の間にDNA型転移因子であるIS2またはIS10Lが挿入されていた。
一方，本製品および蛍光を有するDH5αのコロニー由来のプラスミドでは，lac promoterからGFPにかけての領域は無傷で保存されていた。
継代培養によって，DH5αではISの挿入でプラスミドが損傷したクローンが得られたが，本製品ではISによるプラスミドの損傷が抑制されていることが確認された。
＊5 本製品では，無傷のプラスミドでもLBプレート上で観察されるGFPの蛍光輝度がDH5αよりも低かった（目視で観察可能な蛍光は有していた）。DH5αに比して本製品ではlac promoter制御下でのGFPの発現量が低値である可能性がある。ただし，プラスミドのクローニングおよび精製は問題なく行えた。
IS-mutation Safe開発秘話
本品は株式会社バイオパレットの特許技術である“切らないゲノム編集®” Target-AID®によって開発されました。
ターゲットは、当社実験でプラスミドへの挿入頻度が高かったIS2, IS5, IS10, ISEc63(類似配列)の4種類、大腸菌ゲノム中に存在する計25コピーとしました。
作製した株に対して、IS挿入の抑制によるプラスミドの変異が少なくなることを確認し、発売となりました。
IS-mutation Safeは、ゲノム編集生物を製品化した国内初の例(2020年10月発売)となります。日経バイオテクにも2020年12月に「ゲノム編集技術で育種された生物が日本で初の商品化」として紹介されました。カルタヘナ法規制非該当品とできたのも、意義あることであったと考えています。
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