ONEPotイムノアッセイ

• ELISAより簡単

• Western Blottingより短時間で定量性が高い

  
  
  

• 抗体(Mouse IgG1) 2種類で抗原(タンパク質)をサンドイッチし検出

• 1種類の抗体のみで検出できる場合もあり(多量体を安定して形成するタンパク質の場合)

  
  
  

• ウェルの洗浄は不要

• 抗体のプレートへの固相化は不要

  
  
  

• 抗体と検出用酵素は混合するだけでアフィニティ結合

• 使用抗体量は96 wellあたり約7 μg×2種類と少量

• 蛍光測定用キット(Cat. #DS850)と吸光測定用キット(Cat. #DS860)

任意の抗体(Mouse IgG1)を用いてタンパク質等の抗原を検出する測定系を構築するためのキットです。変異体β-glucuronidase (GUS)を用いた新技術OpenGUS Immunoassayの原理で測定を行います。

*本製品は上田宏博士、北口哲也博士および朱博博士他(国立大学法人東京工業大学科学技術創成研究院（当時）)の研究成果をもとに、BDLが開発、製品化しました。

・対象とする抗原がタンパク質の場合、3 μg/ml以上が含まれるサンプルを推奨します。(100倍希釈して30 ng/mlとして測定することを想定)
・サンプル溶液の組成にシグナル強度が大きく影響される場合があります。
・検出感度は抗原および抗体によって異なります。
・ヒト血清/血漿/血液等のイムノグロブリンが多く含まれるサンプルはバックグラウンドが高くなるため、使用できません。

原理     操作概要     必要器具/試薬     使用例     FAQ    

大腸菌の野生型β-glucuronidase (GUS)は4量体を形成しています。一方、本製品に用いられる変異体GUSは単量体間の親和性が低下しており、2量体は形成するものの4量体をほとんど形成しません。そのため、活性が大きく低下しています。
本製品は抗体結合ドメインを融合させた変異体GUSです。本製品に抗原および抗体を加えることにより、変異体GUSの2量体同士が連結し、4量体が形成されます。こうして形成されたGUS 4量体は活性を有するため、抗原濃度依存的なシグナルを得ることができます。

1) 抗原、抗体とキット付属の酵素を混合
2) 60分間静置
3) 基質添加
4) 60分間静置
5) 測定(蛍光または吸光)

・抗原をサンドイッチ可能なmouse IgG1のペア
・精製抗原 (検量線用)
・96 well plate
・Microplate reader
    蛍光 (Cat. #DS850): 励起光 340 nm / 蛍光 450 nm
    吸光 (Cat. #DS860): 主波長 405nm / 副波長 660 nm
・マルチチャンネルピペッター

唾液および涙中のLactoferrin濃度を、本品を使用して測定し、市販のLactoferrin ELISA kitを用いて得られた結果と比較した。

抗体: Anti-Lactoferrin, Human, Mouse-Mono(1A1) (HyTest, #4L2-1A1)
* 1種類の抗体のみで検出を行った。Lactoferrinは多量体を形成しているため、1種類の抗体のみで検出が行えたと考えている。
* 検量線の縦軸(Absorbance)は[Signal – Background]の値を使用

抗体: Anti-Cry j1, Mouse-Mono(013) (BDL # HBL-Ab-1-013)　および Anti-Cry j1, Mouse-Mono(053) (BDL #HBL-Ab-1-053)
*Cryj1濃縮サンプルからはcryj1の測定が可能だが、環境サンプルからCryj1を検出する感度は得られなかった。
* 検量線の縦軸(FluorescenceおよびAbsorbance)は[Signal – Background]の値を使用

抗体: 抗原: AAV2 empty capsids (PROGEN #66V020)
抗体: Anti-AAV2 (intact particle) mouse recombinant, (A20R) (PROGEN #610298)
*1種類の抗体のみで検出を行った。Capsid表面に整列する抗原を検出しているため、1種類の抗体のみで検出が行えたと考えている。


このほかにもhuman C-Reactive Protein (CRP)、Calf-Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)についての使用例がございます。製品マニュアルをご覧ください。

Q.   蛍光/吸光両方測定可能なプレートリーダーを持っている。蛍光(Cat. #DS850)と吸光(Cat. #DS860)どちらのキットを選べばいいか。
A.   蛍光測定のキット(Cat. #DS850)の方が、若干感度が高い傾向にあるため、こちらをお勧めします。

Q.   インキュベーション時間を短縮できないか。
A.   Signal/Backgroundが充分に高ければ、基質を加える前の4℃60分間のインキュベーションは省くことができます。ただし、この場合もサンプル添加までの作業は氷上で行ってください。

Q.   蛍光基質の反応に使用する25℃のインキュベーターがない。
A.   蓋およびアルミホイルなどをかぶせて遮光し、室温で反応を行ってください。

Q.   アジ化ナトリウムが抗体に含まれているが大丈夫か。
A.   終濃度0.1%のアジ化ナトリウムなら大きな影響はないことを確認しています。

Q.   蛍光測定は、「励起光340nm – 蛍光450nm」意外ではできないのか。
A.   励起光360、蛍光480でも測定できることを確認しています。ただし、感度はやや低下します。

Q.   吸光測定は、405nmでなければいけないか。
A.   405nm周辺であれば測定可能です。ただし、吸光度はやや低下します。バックグラウンドに使用する波長も660nm周辺であれば測定可能です。

Q.   Mouse IgG1以外の抗体は使用できないか。
A.   本品はmouse IgG1に最適化されています。Mouse IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3ではバックグラウンドが高くなる抗体クローンが存在することを確認しています。またRabbit polyclonal抗体でもバックグラウンドが高くなることを確認しています。

Q.   抗タグ抗体は使用できるか。
A.   Anti-6xHis抗体は使用できません。その他の抗タグ抗体については確認を行っておりません。

Q.   どの程度の濃度のタンパク質を測定できるのか。
A.   抗原、抗体によって測定できる範囲は異なります。下記『検量線を作成できた抗原濃度範囲』をご参照ください。

検量線を作成できた抗原濃度範囲 (基質反応時の抗原濃度)
Lactoferrin:   3 – 824 ng/ml (0.04 – 10 nM)
CRP:   0.06 – 57 ng/ml (0.0005 – 0.5 nM)
Cryj1:   3.4 – 117 ng/ml (0.08 – 3 nM)
CIAP:   66 – 4200 ng/ml (0.47 – 30 nM)
AAV2 (empty capsids):   9.4×10⁸ – 6.0×10¹⁰ copy/ml

関連文献
1) J. Su, D. Jinhua, T. Kitaguchi, Y. Ohmuro-Matsuyama and H. Ueda. Noncompetitive homogeneous immunodetection of small molecules based on beta-glucuronidase complementation. Analyst 143, 2096-2101 (2018)
2) J. Su, C. Beh, Y. Ohmuro-Matsuyama, T. Kitaguchi, S. Hoon and H. Ueda. Creation of stable and strictly regulated enzyme switch for signal-on immunodetection of various small antigens. J. Biosci. Bioeng. 128, 677-682 (2019)
3) J. Su, T. Kitaguchi, Y. Ohmuro-Matsuyama, T. Seah, F.J. Ghadessy, S. Hoon and H. Ueda. Transmembrane signaling on a protocell: Creation of receptor-enzyme chimeras for immunodetection of specific antibodies and antigens. Sci. Rep. 9, 18189 (2019)
4) B. Zhu, C. Qian, H. Tang, T. Kitaguchi and H. Ueda. Creating a thermostable beta-glucuronidase switch for homogeneous immunoassay by disruption of conserved salt bridges at diagonal interfaces. Biochemistry 62, 309–317 (2023)



関連製品
BCA Protein Assay Kit
Cry j 1, Cedar Pollen Allergen, Purified
Anti-Cry j1, Mouse-Mono(013)
Anti-Cry j1, Mouse-Mono(053)



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コード

DS850

製品名

ONEPot Immunoassay Kit, Fluorescent <OpenGUS Method>

容量

1 Kit (100 well分)

価格

63,000円

製品マニュアル

JP

SDS

JP

コード

DS860

製品名

ONEPot Immunoassay Kit, Colorimetric <OpenGUS Method>

容量

1 Kit (100 well分)

価格

63,000円

製品マニュアル

JP

SDS

JP

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